小鼠原代視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞注意事項(xiàng)

小鼠原代視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞注意事項(xiàng)：

1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時(shí)間證明，期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4.所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。續(xù)寫內(nèi)容：

5. 細(xì)胞傳代時(shí)，建議使用預(yù)溫的PBS輕柔洗滌2-3次，以徹底去除殘留的培養(yǎng)基和血清成分，避免消化酶活性受影響。消化時(shí)間需嚴(yán)格控制，通常以0.25%胰酶（含EDTA）在37℃下作用1-2分鐘為宜，鏡下觀察到細(xì)胞間隙增大、邊緣收縮即可終止消化。過度消化可能導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，影響后續(xù)貼壁和增殖。

6. 原代視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）對(duì)培養(yǎng)基成分敏感，建議使用專用培養(yǎng)基（如DMEM/F12添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸及2mM L-谷氨酰胺），并每2-3天更換一次。若細(xì)胞出現(xiàn)生長遲緩或形態(tài)扁平化，可嘗試添加5ng/mL bFGF以促進(jìn)活力。換液時(shí)需保留1/3原培養(yǎng)基，避免環(huán)境驟變導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激。

7. 凍存復(fù)蘇需注意梯度降溫：4℃ 30分鐘→-20℃ 2小時(shí)→-80℃過夜→液氮長期保存。復(fù)蘇時(shí)需快速解凍，37℃水浴中輕搖至冰晶消失，立即轉(zhuǎn)移至含10倍體積培養(yǎng)基的離心管中，低速離心后棄上清，重懸接種至預(yù)鋪膠原蛋白的培養(yǎng)皿（密度建議5×10?/cm2）。前24小時(shí)避免頻繁觀察，減少擾動(dòng)。

8. 功能性實(shí)驗(yàn)（如吞噬實(shí)驗(yàn)、屏障功能檢測）建議在細(xì)胞傳代后第3-5代進(jìn)行，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定且功能成熟。若需誘導(dǎo)極化，可采用Transwell小室培養(yǎng)21天，定期檢測跨膜電阻（TEER）值至穩(wěn)定＞200Ω·cm2。操作時(shí)注意氣液界面濕度控制，避免邊緣效應(yīng)影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

9. 定期進(jìn)行STR鑒定和支原體檢測，尤其長期培養(yǎng)時(shí)需每2個(gè)月驗(yàn)證一次。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)異常空泡化或顆粒增多，可嘗試添加1%雙抗處理48小時(shí)，并排查培養(yǎng)箱CO?濃度（保持5%）及濕度（95%）是否達(dá)標(biāo)。建議建立不同批次的工作細(xì)胞庫，避免實(shí)驗(yàn)中斷風(fēng)險(xiǎn)。