概述：
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產物不斷積累，熒光信號也會相應的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監(jiān)測。產品僅供科研使用本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。

實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性*的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物考核、病原體檢測等諸多領域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

使用方法：
一、大鼠源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。
11. 產品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）

熒光定量PCR服務：
產品僅供科研使用簡介：實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準。
中國倉鼠肺細胞;CHL[Phe2,Orn8]-催產素質量規(guī)格：>95%,BR[Phe2,Orn8]-Oxytocin

BxPC-3細胞，人原位胰腺腺癌細胞 人皮膚纖維微細胞系,Malmc細胞 小鼠漿細胞瘤;MPC-11[Ser4,Ile8]-催產素質量規(guī)格：>95%,BR[Ser4,Ile8]-Oxytocin

HT-1080(人纖維細胞) 5×106cells/瓶×2[Tyr34]-甲狀旁腺激素(7-34) 酰胺 (牛)質量規(guī)格：>95%,BR[Tyr34]-pTH (7-34) amide (bovine)

Gibco 17104019 Collagenase Type IV 1g[Trp4]-Kemptide質量規(guī)格：>95%,BR[Trp4]-Kemptide

人髓核細胞裂解物HNPCL（標準品）質量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品Coumarin
RK1 Others Mouse 小鼠 kA / RK1 人細胞裂解液 (陽性對照) 左旋肉堿；維生素BT；左卡尼汀質量規(guī)格：>98%,BRL(-)-Carnitine

人心肌細胞cDNAHCM cDNA左卡尼汀;左旋肉堿（標準品）質量規(guī)格：HPLC含量測定Levocarnitine;L(-)-Carnitine

MX-1細胞，人癌細胞 豬腎細胞系,PK-15細胞 大隱平滑肌細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)L-谷氨酸鈉，一水質量規(guī)格：>99%L-Glutamic acid mono salt hydrate

VE(人內皮細胞) 5×106cells/瓶×2DL-賴氨酸鹽酸鹽質量規(guī)格：>98%,BRDL-Lysine·HCl

HUtMEC Pellet 人子宮微內皮細胞團塊 > 1 mio.cells 肌細胞分離液MDSDL-正纈氨酸質量規(guī)格：>98%,BRDL-Norvaline
人胚;MRC-5氧化型輔酶Ⅱshēng huà shì jì容量：RT25克

HA Others H5N8 甲型 H5N8 (A/duck/NY/191255-59/2002) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人細胞裂解液 (陽性對照) 5-溴尿嘧啶 5-BroMourccil;5-BroMo-2,4(1H,3H)-pyriMidinqdionq; 21-0-7

NSC，大鼠神經干細胞溴紫葡萄糖肉湯shēng huà shì jì容量：25克

CD38 Others Human 人 SCARB3 人細胞裂解液 (陽性對照) 抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基(Ph6.5～6.6)shēng huà shì jì容量：RT25克

大鼠視網膜微內皮細胞完全培養(yǎng)基 100mLRhamnose 5g/10g/100g 國產
大鼠源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒FCGR3 Others Cynomolgus 食蟹猴 CD16 / FCGR3 人細胞裂解液 (陽性對照) 磺胺嘧啶Sulfadiazine質量規(guī)格：美國進口

INS-1 大鼠細胞N-乙酰基磺胺嘧啶N-Acetyl Sulfadiazine質量規(guī)格：美國進口

中國倉鼠卵巢細胞系;CHO-TGF-beta-3/2000 Carrying Psv2-beta-TGF5'-羥基苯卡維地洛5'-Hydroxyphenyl Carvedilol質量規(guī)格：美國進口

LncaP, 人細胞O-去甲卡維地洛O-Desmethyl Carvedilol質量規(guī)格：美國進口

人急性T細胞細胞;Jurkat, Clone E6-1 大鼠肝動脈內皮細胞完全培養(yǎng)基 100mL4'-羥苯基卡維地洛4'-Hydroxyphenyl Carvedilol質量規(guī)格：美國進口
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。