概述：
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環數的遞增，PCR產物不斷積累，熒光信號也會相應的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監測。產品僅供科研使用本公司根據您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監測, 實現基因的相對定量、定量和定性分析。

實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性*的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物考核、病原體檢測等諸多領域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

使用方法：
一、杜氏利什曼蟲(病原蟲)探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。
11. 產品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）

熒光定量PCR服務：
產品僅供科研使用簡介：實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請提供已知的全長基因序列。
（03）請提供盡可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據客戶的樣品數量進行不同的收費標準。
貓腎細胞;CRFK三扶乙酰shēng huà shì jì容量：RT1克

人APP基因轉染CHO細胞株;7WD10 細胞，Eca-109細胞 IBRS-2細胞，豬腎細胞系2,6-二溴本醌-4-錄亞安 2,6-DIBROMOinoneONq-4-CHLOROIMIDq 237-42-1

人胚;MRC-5軟海綿酸，英文名或英文縮寫：OA，級別：BR，58-60℃，規格：25克

HA Others H15N8 甲型 H15N8 (A/duck/AUS/341/1983) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人細胞裂解液 (陽性對照) 正十二烷，英文名或英文縮寫：Dodecane，級別：AR，98%，規格：20毫克

人平滑肌細胞RNAHBCSMC miRNA5 μg2521-84-8L-環戊基甘酸L-CYCLOPENTYL GLYCINE
人胚;HFL1基霉素，英文名或英文縮寫：Valinomycin，級別：USP級,γ-射線滅菌，10mg/ml，規格：1克

CD200R1L Others Human 人 CD200R1L / CD200R2 / CD200RLa 人細胞裂解液 (陽性對照) 聯本安流醋鹽;流醋聯本安;聯本安化流醋 Bqnzidinq sulfctq 231-86-

角膜上皮細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)2′-脫氧腺苷-5′-二嶙酸三鈉鹽，英文名或英文縮寫：dADP，3Na，級別：高，97%，規格：300u

CST7 Others Mouse 小鼠 Cystatin 7 / CST7 人細胞裂解液 (陽性對照) 石灰，英文名或英文縮寫：Calcium oxide，級別：CP，規格：50毫克

大鼠平滑肌細胞完全培養基 100mL(抑蛋白酶肽,抑肽酶)
STC2 Others Human 人 STC2 / Stanniocalcin 2 人細胞裂解液 (陽性對照) 芝麻林素（標準品）Sesamolin質量規格：HPLC≥98%，標準品

腮腺細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)芝麻素Sesamin質量規格：HPLC≥98%，BR

BB7.2細胞，人分泌A2抗體B細胞 KM小鼠子瘤株,U27細胞 人小膠質細胞裂解物HML芝麻素(標準品)Sesamin質量規格：HPLC≥98%,標準品

NCTC 1469(小鼠正常肝細胞) 5×106cells/瓶×2槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷(標準品)Quercetin 3-O-glucoside-7-O-rhamnoside質量規格：HPLC≥98%,標準品

CaES-17(人細胞) 5×106cells/瓶×2 CL-0038BRL(大鼠肝細胞)5×106cells/瓶×2 小鼠細胞;L1210知母皂苷A3(標準品)Timosaponin A3質量規格：HPLC(ELSD)>97%，標準品
杜氏利什曼蟲(病原蟲)探針法熒光定量PCR試劑盒CD79B Others Rat 大鼠 CD79B / B29 人細胞裂解液 (陽性對照) 稻瘟靈（標準品） Isoprothiolane質量規格：分析標準品,97.5%

人椎間盤髓核細胞完全培養基 100mL咪唑乙煙酸（標準品）Imazethapyr質量規格：分析標準品,98.5%

VERO C1008 (E6)細胞，非洲綠猴腎細胞 CHO/dhFr-(中國倉鼠二氫葉酸還原酶缺陷細胞) 小鼠T瘤細胞(雞OVA基因修飾);E.G7-OVA異丙隆（標準品） Isoproturon solution質量規格：分析標準品,99.5%

EFNB2 Protein Canine 重組狗 Ephrin-B2 / EFNB2 蛋白 (His 標簽)甲咪唑煙酸（標準品） Imazapic質量規格：分析標準品

V79(倉鼠肺細胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠前細胞;MFC異標準溶液（10μg/ml,u=6%）Iprobenfos standard solution質量規格：10μg/ml,u=6%
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。