大鼠原代角膜成纖維細(xì)胞操作步驟

大鼠原代角膜成纖維細(xì)胞操作步驟:
棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1 - 2次。
加2ml消化液（0.25% Trypsin - 0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 - 2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
按6 - 8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1 - 2mL培養(yǎng)液后吹勻。
將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
復(fù)蘇步驟：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1 - 2mL培養(yǎng)基后吹勻。換液并檢查細(xì)胞密度。
凍存步驟：
以T25瓶為例：
細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1 - 2次后加入1ml，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
1000RPM離心5分鐘去掉上清，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
將凍存管置于程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存，記錄凍存管位置以便下次拿取。