尋常圓線蟲探針法熒光定量PCR檢測試劑盒反應的特異性決定因素

尋常圓線蟲探針法熒光定量PCR檢測試劑盒反應的特異性決定因素

1.引物與模板DNA特異正確的結合。

2.堿基配對原則。

3. Tag DNA聚合酶合成反應的忠實性。

4.靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及 Tag DNA聚合醇耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大増加加,被擴増的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。

靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式増加的,能將皮克(pg=10-129)量級的起始待測模板擴増到微克(ug=10-69)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中zu小檢出率為3個細菌。

(3)簡便、快速

PCR反應用耐高溫的 Tag DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴増液和水浴鍋上進行變性退火-延伸反應,一般在2-4小時完成擴増反應。擴増產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。

(4)對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA粗制品及總RNA均可作為擴増模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活PCR技術概論。